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植物バイオ工学 細胞育種技術実験法

コードNO0081
発刊日1985年12月5日
編集者
山田康之 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター教授
大山莞爾 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター助教授
価 格本体12,000円+税
体 裁A4判並製(ケース付) 188頁
試 読  不可 
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植物バイオ工学 “植物バイオ”−特色ある新種子・品種の開発期間を短縮させ、植物栽培を工業生産(量産技術)に変えつつあるバイオテクノロジーの最大の課題=何から始めるかに応える、初めての真意球種技術開発のための実験法マニュアル

主要構成

第1部 細胞工学的手法
第2部 遺伝子工学的手法
第3部 遺伝資源の保存
発刊にあたり

近年細胞育種、分子育種による植物の品種改良、新品種育成の研究が盛んとなっているが、その成果は非常に限られた植物種のみに限られており。特に禾穀類や木本植物などの領域では、その研究の進歩は遅々としている。この傾向は我が国における研究機関のみならず、国際的にみても同じ様相を呈しており、広い植物範囲にまで適用される細胞育種、分子育種の技術の確立が強く望まれるところである。
今回(株)サイエンスフォーラムより、細胞育種技術実験法の編集依頼を受け、いろいろと考えた結果、一般的な基本的実験書を編集するより、むしろ細胞育種と分子育種にしぼりこまれた限定された領域であるが、しかし異なった植物種についての技術手法を示した実験書を刊行することにした。しかも、植物種もイネ、木本植物など、未だ技術的に完全に確立していないが、重要である植物実験例を含んだ実験書とし、執筆者も日夜これらの材料を使って実験研究を実施しておられる新進気鋭の若い研究者の方々に依頼することにした。
実験書は3部から成り立っており、第T部は細胞融合、融合細胞の分離・培養、ならびに細胞から個体再生の実験方法から成っている。特にプロトプラストを用いた細胞融合について数種の植物の実験例を詳しく記述していただいた。
第U部は、組換えDNA法、形質転換体の選抜・培養法から成り立っており、植物遺伝子のクローニング、ベクター開発法、遺伝子導入法を中心として、植物細胞における形質転換ができることを目指し、第一線で実際に実験している方々に新しい技術を書いていただいた。
第V部は、遺伝子バンクの作成法と細胞の凍結保存法の構成とし、今後重要となる遺伝子ライブラリーの作製、細胞の凍結保存方法について実際に応用できるように書いていただいた。
執筆者として我が国の新進気鋭の第一線の研究者の他、カナダ国立植物生物工学研究所のKao、Kartha両博士にもご協力いただいた。さらにカナダNRCより翻訳権を快く許可していただいたことを心より感謝したい。
また、本実験書の編集に当たり編集者の意見をできるだけ受け入れ、かつ価格についてもできるだけ廉価に努力していただいた(株)サイエンスフォーラムに謝意を呈します。
山田康之/大山莞爾

内容目次


第1部 細胞工学的手法

現状<大山莞爾>......14

第1章 細胞融合法

第1節 プロプラストの単離・培養と融合法

1. 細胞培養

 イネ種カルスの誘導および培養法<森 宏一> ......16
  1. 実験の準備......16
  2. A.機器
    B.試薬等
    C.実験材料
  3. 実験方法......17
  4. A.器具等の滅菌
    B.培地の準備
    C.種子のカルス誘導
    D.継代培養
  5. 実験の考察......18
 ニンジン培養細胞の誘導と維持<駒嶺 穆/野村港二> ......19
  1. 培養機器......19
  2. 培養液......19
  3. 根からのカルス誘導......20
  4. ●実験の準備
    ●実験方法
  5. めばえからの懸濁培養誘導......20
  6. (i)無菌的なめばえの作り方
    ●実験の準備
    ●実験方法
    (ii)めばえからの懸濁培養の作り方
    ●実験の準備
    ●実験方法
  7. ストレイン選択の重要性......22
2. 変異株の単離

 半数体シャクヤクNR-突然変異株の単離法<小野莞爾>......23
  1. 実験の準備......23
  2. A.機器
    B.試薬等
    C.実験材料
  3. 実験方法......24
  4. A.単離花粉培養による半数体カルスの誘導
    B.懸濁培養細胞の確立方法
    C.NR-株の誘導と単離法
    D.NR活性の測定法
  5. 実験の考察......26
 イネの硝酸還元酵素欠失変異株の選抜法<若狭 暁>......27
  1. 実験の準備......27
  2. A.機器
    B.試薬等
    C.実験材料
  3. 実験方法......28
  4. A.カルス作成と選抜法
    B.NADH-硝酸還元酵素活性の測定法
  5. 実験の考察......29
  6. A.突然変異誘発処理の必要姓
    B.選抜結果
 ニンジンアルミ耐性株の単離法<小島邦彦>......31
  1. 実験の準備......31
  2. A.選抜用培地の作製
    B.培養液の分注
    C.Alストレス剤の作製
    D.ガラス機器などの準備
    E.機器類の準備
    F.実験材料
  3. 実験方法......32
  4. 実験の考察......33
 光独立栄養緑色(タバコ)培養細胞の選抜的培養法<佐藤文彦>......34
  1. 実験の準備......34
  2. A.培養設備
    B.試薬
    C.実験材料
  3. 実験方法......36
  4. A.カルス誘導
    B.カルス化
    C.緑色カルスの選抜
    D.光独立栄養培養
  5. 実験の考察......38
3. プロトプラストの分離・培養

 イネプロトプラストの分離・培養法<山田康之/楊 志g>......39
  1. 実験の準備......39
  2. A.機器・設備
    B.酵素と試薬
  3. 実験例......39
  4. A.イネ品種トヨタマの懸濁培養細胞
    B.イネプロトプラスト作製のための酵素液の調製
    C.懸濁培養細胞とプロトプラスト単離液のインキュベーション
    D.プロトプラストの精製
    E.プロトプラストの培養
  5. 実験の考察......40
 ダイズの培養細胞のプロトプラストの単離・培養法<新関 稔>......43
  1. 実験の準備......43
  2. A.カルスの誘導
    B.プロトプラスト単利用酵素液の作り方
    C.プロトプラスト培養液の組成
  3. 実験方法......44
  4. A.カルスからのプロトプラストの単離と培養
    B.懸濁培養細胞からのプロトプラストの単離についてのKaoとMichayluk(1974)の方法
  5. 実験の考察......45
 木本植物(クワ科)におけるプロトプラストの分離と培養法<大山勝夫>......31
  1. 実験の準備......47
  2. A.機器・設備
    B.試薬等
  3. 実験方法......47
  4. A.実験材料の育成
    B.プロトプラスト採取材料の調製
    C.プロトプラストの分離法
    D.プロトプラストの培養法
    E.実験手順
  5. 実験の考察......49
4. 細胞融合法

 植物プロトプラスト融合と異種融合細胞の単離<K.N.Kao/大山莞爾 訳>......51
  1. 実験の準備......51
  2. A.機器・装置
    B.実験材料
    C.試薬類
    D.培地
  3. 実験方法......53
  4. A.プロトプラスト調製
    B.融合
    C.プロトプラストの培養
    D.異種融合細胞(大豆-N.glauca)の単離と培養
  5. 実験の考察......55
 電気パルスによる細胞融合法<森川弘道>......56
  1. 電気融合法......56
  2. A.微小電極法
    ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察
    B.平行電極法
    ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察
    C.Dielectrophoresis chamber法
    ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察
  3. 直接選抜(ピックアップ)法......58
  4. ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察
第2章 融合細胞の分離・培養

第1節 分離同定法

 薬剤(アミノ酸アナローグ)耐性選抜法<亀谷寿昭> ......62
  1. 実験の準備......62
  2. A.機器・設備
    B.試薬・培養液
    C.実験材料
  3. 実験方法......63
  4. A.プロトプラストの分離法
    B.融合処理法
    C.選抜培養法
    D.耐性度の検定法
  5. 実験の考察......63
 リボソームRNA遺伝子による同定法<内宮博文> ......65
  1. 実験の準備......65
  2. A.分析材料
    B.核DNA抽出用
    C.rDNA分析用
  3. 実験方法......65
    A.核DNAの抽出
    B.制限酵素によるDNAの切断、電気泳動、ハイブリダイゼーション
  4. 実験の考察......66
 色素細胞による融合細胞の選別法<足立泰二> ......67
  1. 実験の準備......67
  2. A.機器
    B.試薬類
    C.実験材料
  3. 実験方法......68
  4. A.直接選別法
    B.間接選別法
  5. 実験の考察......68
第2節 融合細胞の培養

 X線照射による融合細胞の選抜・培養法 ─ 細胞融合法を利用した部分ゲノムの導入法 ─<伊藤一弥/平井篤志> ......69
  1. 実験の準備......69
  2. A.器具
    B.試薬
    C.実験材料
  3. 実験方法......70
  4. A.培養細胞の誘導、液体懸濁培養
    B.プロトプラストの単離および不活性化
    C.プロトプラストの融合
    D.雑種細胞の培養・選抜
  5. 実験の考察......71
第3章 個体再生

第1節 培養細胞からの個体再生

 タバコ培養細胞からの植物体再生法<島本 功> ......74
  1. 実験の準備......74
  2. A.器具・器材
    B.培地
    C.実験材料
  3. 実験方法......75
  4. 実験の考察......75
 ニンジン培養細胞からの不定胚分化の誘導法─分化のモデル系─<野村港二/駒嶺 穆> ......77
  1. カルスからの分化の誘導......77
  2. 懸濁培養細胞からの不定胚分化......77
  3. ●実験の準備
    ●実験方法
  4. 不定胚分化の高頻度、同調化......78
  5. ●実験の準備
    ●実験方法
  6. 単細胞からの不定胚分化......79
  7. ●実験の準備
    ●実験方法
  8. プロトプラストからの不定胚分化......80
  9. ●実験の準備
    ●実験方法
 イネ培養細胞からの植物体細分化法<島田多喜子> ......81
  1. 実験の準備......81
  2. 実験方法......81
  3. A.根由来カルス
    B.花粉由来カルス
    C.再分化植物の育成法
  4. 実験の考察......82
第2節 融合培養細胞からの個体再生

 ペチュニア種間における体細胞雑種の作出法<伊藤一弥/平井篤志> ......81
  1. 実験の準備......84
  2. A.器具
    B.試薬
    C.実験材料
  3. 実験方法......85
  4. A.培養細胞の誘導、液体懸濁培養
    B.プロトプラストの単離−培養細胞
    C.プロトプラストの単離−葉肉細胞
    D.プロトプラストの融合
    E.雑種細胞の培養
  5. 実験の考察......87

 

第2部 遺伝子工学的手法

現状<大山莞爾>......90

第1章 組換えDNA法

第1節 植物遺伝子のクローニング法

 ダイズ11Sグロブリン(グリシニン)のcDNAのクローニング法<深澤親房> ......92
  1. クローニングの留意点......92
  2. mRNAの抽出精製とそのQualityの検証......93
  3. SDS-フェノール法によるダイズ種子全RNAの抽出......93
  4. ●実験の準備
    ●実験操作
  5. cDNAライブラリーの作成......94
  6. Landの変法によるds-cDNAの合成とクローニング......96
  7. A.ss-cDNAの合成と鋳型mRNAのアルカリ分解
    ●実験の準備
    ●実験操作
    B.ss-cDNAの3'-OH末端へのdCホモポリマーの付加
    ●実験の準備
    ●実験操作
    C.ds-cDNAの作製
    ●実験の準備
    ●実験操作
    D.プラスミドへ挿入のためのds-cDNAの末端の加工
    ●実験の準備
    ●実験操作
    E.Pst I 切断3'末端オリゴdG付加pBR322とのアニーリング
    ●実験の準備
    ●実験操作
    F.形質転換(トランスフォーメーション)
    G.cDNAクローンの選別(スクリーニング)
 イネグルテリン遺伝子のクローニング法<田中國介> ......101
  1. 材料とその貯蔵......101
  2. mRNAの調製......101
  3. ●実験の準備
    ●実験方法
  4. cDNAのクローニング......102
    ●実験の準備
    ●実験方法
  5. おわりに......104

 小麦遺伝子ライブラリーからのヒストン遺伝子のクローニング法<多羽田哲也/岩淵雅樹> ......105
  1. プラークハイブリダイゼーション......105
  2. ●実験の準備
    ●実験方法
  3. λクローンの同定とプラスミドベクターへの再クローニング......106
  4. (i)λファージDNAの抽出(簡便法)
    ●実験の準備
    ●実験方法
    (ii) プラスミドベクターへの再クローニング
    ● 実験の準備
    ● 実験操作
  5. ヒストン-CATキメラ遺伝子の作製 ......107
  6. ●実験の準備
    ●実験操作
  7. 実験の考察......109

 テンサイのミトコンドリアDNA調整法とクローニング<三上 哲夫> ......111
  1. mRmtDNAの抽出......111
  2. ●実験の準備
    ●実験方法
  3. mtDNAの精製 ......112
  4. ●実験の準備
    ●実験操作
  5. mtDNAのSalI断片のクローニング ......113
  6. (i)pBR322のSalT処理とアルカリホスファターゼ処理
    ●実験の準備
    ●実験操作
    (ii) mtDNAのSalT断片とベクターとの結合
    ● 実験の準備
    ● 実験操作
    (iii) 形質転換
    ● 実験の準備
    ● 実験操作

第2節 ベクターの調製法とベクター化

 Tiプラスミドを利用した遺伝子導入方法<村井紀元> ......115
  1. 実験の準備......116
  2. A. 機器
    B. 試薬
  3. 実験方法 ......116
  4. A. Agrobacterium tumefaciensの培養
    B. Tiプラスミドの抽出
    C. BamHI-17フラグメントの単離と修整
    D. 中間ベクターの調整
    E. Tiプラスミドへの導入
  5. 実験の考察......120

 CaMV DNAの調製法とクローニング<酒井富久美> ......121
  1. CaMV DNAの調製法......121
  2. ●実験の準備
    ●実験方法
    ●実験の考察
  3. CaMV DNAのSalT断片のpBR322によるクローニング ......122
  4. ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察
 ウイロイドRNA─感染性cDNAプラスミドの作製法<岡田吉美>......123
  1. 実験の準備......123
  2. A. プラスミド
    B. 酵素反応
    C. 大腸菌HB101とトランスフォーメーション
    D. キュウリ
  3. 実験方法......125
  4. A. 1ユニットのHSV-cDNA挿入配列を持つプラスミドの作製
    B. 2ユニット以上のHSV-cDNAのタンデムリピートを挿入配列として持つプラスミドの作製
    C. HSV-cDNAプラスミドの感染性
    D. 転写反応を利用した感染性HSVの試験管内合成
  5. 実験の考察......127

 ゼニゴケ葉緑体DNA調製法とベクター化<大山莞爾>......128
  1. 実験の準備......128
  2. A. 器具・機器・装置
    B. 実験材料・試薬類
  3. 葉緑体DNAの調整法......128
  4. A. 葉緑体の単離
    B. 葉緑体DNAの単離
  5. 葉緑体in vitroDNA合成......129
  6. A. 葉緑体DNAポリメラーゼ画分の調整
    B. In vitroDNA合成反応法
  7. 葉緑体遺伝子プロモーターのクローニング法 ......130
  8. A. 大腸菌ベクターpMC1403による葉緑体DNAショットガンクローニング
    B. 葉緑体DNA断片の回収法
    C. コロニーハイブリダイゼーション
  9. 実験の考察 ......130

第3節 遺伝子導入法

 共存培養法(Tiプラスミド)<庄野邦彦>......132
  1. 実験の準備......132
  2. A. 機器・設備
    B. 試薬・器具
    C. 実験材料
  3. 実験方法......133
  4. 実験の考察......135

 リポソームを用いた植物プロトプラスト内遺伝子導入法<福永行雄>......137
  1. 実験の準備......137
  2. A. 機器・設備類
    B. 試薬類
    C. 実験材料
  3. 実験方法......138
  4. A. リポソームの調製
    B. プロトプラストの調製
    C. プロトプラストとリポソームのインキュベーション
  5. 実験の考察......139

 CaMV DNAによる遺伝子導入法─植物へ外来遺伝子を導入するためのベクターとしてのCaMV DNAの利用法─<酒井富久美>......141
  1. ORFU領域を利用してdihydroforate reductase(dhfr)遺伝子を植物体へ導入する方法......141
  2. ●実験の準備
    ●実験の考察
  3. CaMV DNAのプロモーターを利用してカナマイシン耐性遺伝子を植物細胞へ導入する方法......142
  4. ●実験の準備
    ●実験操作
    ●実験の考察

第2章 形質転換体の選抜・培養法

第1節 形質転換体の選抜培養と確認

 ファゼオーリン遺伝子のタバコ植物体への導入とその発現<村井紀元>......146
  1. 実験の準備......146
  2. A. 機器
    B. 試薬
    C. 実験材料
  3. 実験方法......147
  4. A. Agrobacteriumによる接種
    B. 形質転換した細胞の選抜と培養
    C. 形質転換植物体の種子繁殖
    D. ELISAによるファゼオーリンの検出
  5. 実験の考察......148

第3部 遺伝資源の保存

現状<大山 莞爾>......152

第1章 遺伝子バンクの作成法

 シャロン4ファージベクターを用いた小麦遺伝子ライブラリーの作製<多羽田哲也/岩淵雅樹>......154
  1. シャロン4アームの調製......154
  2. ●実験の準備
    ●実験手順
  3. インサートDNAの調製......156
  4. ●実験の準備
    ●実験手順
  5. in vitroパッケージング ......156
  6. ●実験の準備
    ●実験材料
    ●実験手順
  7. 実験の考察......158

 プラスミドpBR322、pKC7, pUC13によるゼニゴケ葉緑体DNAのクローニング法<大山莞爾/福澤秀哉>......159
  1. 実験の準備......159
  2. A. 機器・装置
    B. 実験材料・緩衝液類・試薬類
  3. pKC7プラスミドによるクローニング法......160
  4. A. プラスミドの大量調製法(アルカリ法)
    B. pKC7BglU切断とアルカリフォスファターゼ処理
    C. 葉緑体DNAのBglU切断とLigation反応
    D. カルシウム処理菌の調製
    E. 組換えDNAの大腸菌への導入(形質転換)
    F. Negative Selectin
    G. 迅速・小規模プラスミド単離法
    H. 単離したプラスミドの制限酵素切断による確認
  5. pUC13によるクローニング法......162
  6. 実験の考察......162

 ゼニゴケ葉緑体DNAの限定ショットガンクローニング法<大山莞爾/河内孝之>......164
  1. 実験の準備......164
  2. A. 器具・装置
    B. 実験材料・緩衝液類・試薬類
  3. M13ショットガンライブラリーの作成......165
  4. A. 超音波によるDNAの断片化
    B. DNA断片の平滑末端化
    C. ディスクゲルによるDNA断片の分画回収
    D. ベクターDNAの調製
    E. Ligation
    F. トランスフェクション
  5. ドットハイブリダイゼーションによる組換えファージの限定......166
  6. A. ファージの培養とフィルターの作成
    B. プローブの作成
    C. ハイブリダイゼーション
  7. 実験の考察......167

第2章 培養細胞の凍結保存法

 ニンジン培養細胞とプロトプラスト<菅原康剛>......170
  1. 実験の準備......170
  2. A. 器具
    B. 試薬
    C. 実験材料
  3. 実験方法......171
  4. A. 培養細胞の凍結保存
    B. プロトプラストの凍結保存
    C. 生存率の判定
  5. 実験の考察......172

 ニチニチソウのアルカロイド生産株・非生産株<K.K.Kartha/大山莞爾 訳>......174
  1. 実験の準備......174
  2. A. 機器・装置
    B. 実験材料・試薬
  3. 前処理......174
  4. A. C.roseusのアルカロイド非生産株の前培養
    B. アルカロイド生産株の前培養. プロトプラストの凍結保存
  5. 凍結防止剤の添加と凍結......175
  6. 再培養と生存率のアッセイ法 ......175
  7. A. アルカロイド非生産株の再培養
    B. アルカロイド生産株の再培養
  8. 他の生存率アッセイ法.....176
  9. A. Fluoroscein diacetate(FDA)染色法
    B. Triphenyltetrazolium chloride法(TTC法)
  10. 実験の考察......176

付属資料:
植物個体を宿主とする組換えDNA実験及び組換え体の植物個体への接種を含む実験に関する考え方について......178

索引.....181
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執筆者(敬称略/執筆順、肩書等は発刊時のものです)
 
山田 康之 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター教授
大山 莞爾 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター助教授
森 宏一 北海道大学農学部農学科助教授
駒嶺 穆 東北大学理学部生物学科教授
野村 港二 東北大学大学院博士課程(生物学専攻)
小野 莞爾 熊本大学理学部生物学科教授
若狭 暁 農林水産省農業生物資源研究所細胞育種部細胞育種研究室主任研究官
小島 邦彦 東北大学農学部農芸化学科助教授
佐藤 文彦 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター助手
楊 志g 京都大学大学院博士課程(農芸化学専攻)
新関 稔 弘前大学農学部農学科助教授
K.N.Kao カナダ国立植物生物工学研究所、サスカートン、カナダ (Plant Bio-technological Institute, National Research Coucil of CANADA)
森川 弘道 京都大学農学部生物細胞生産制御実験センター助教授
亀谷 寿昭 東北大学農学研究所助教授
内宮 博文 筑波大学生物科学系講師
足立 泰二 宮崎大学農学部農学科助教授
伊藤 一弥 王子製紙(株)林木育種研究所亀山育種場
平井 篤志 名古屋大学農学部生化学制御研究施設助教授
島本 功 (株)植物工学研究所研究員
島田多喜子 石川県農業短期大学農業資源研究所講師
深澤 親房 農林水産省食品総合研究所応用微生物部微生物機能工学研究室室長
田中 國介 京都府立大学農学部農芸化学科生物化学教室助教授
多羽田哲也 北海道大学理学部生物学科奨励研究員
岩淵 雅樹 北海道大学理学部生物学科植物学教室助教授
三上 哲夫 北海道大学農学部農学科助手
村井 紀元 農林水産省農業生物資源研究所分子育種部形質転換研究室長
酒井富久美 農林水産省農業生物資源研究所分子育種部核外遺伝子研究室長
岡田 吉美 東京大学理学部生物化学科教授
庄野 邦彦 東京大学教養学部基礎科学科助教授
福永 行雄 (株)学研 植物工学研究所主任研究員
福澤 秀哉 京都大学農学部大学院(農芸化学専攻)
河内 孝之 京都大学農学部大学院(農芸化学専攻)
菅原 康剛 埼玉大学理学部生体制御学科助手
k.k.kartha カナダ国立植物生物工学研究所、サスカートン、カナダ(Plant Bio-technological Institute, National Research Coucil of CANADA)


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